Quan­ti­ta­ti­ve Bestim­mung von Pseu­do­mo­nas aeru­gi­no­sa in Bade­ge­wäs­sern

Ps. aeru­gi­no­sa ist ein ubi­qui­tär ver­brei­te­tes Bak­te­ri­um, das auch in nähr­stoff­ar­men Wäs­sern wie Trink­was­ser und Schwimm­bä­dern vor­kommt.   Ps. aeru­gi­no­sa hat einen gerin­gen Nähr­stoff­be­darf und ist in der Lage die unter­schied­lichs­ten Sub­stra­te zu ver­wer­ten [1, 2].  Neben ali­pha­ti­schen Koh­len­was­ser­stof­fen wie Par­af­fin wer­den auch Xeno­bio­ti­ka, wie z.B. Pes­ti­zi­de und ande­re toxi­sche Stof­fe abge­baut. Da Ps. aeru­gi­no­sa beson­ders  für immun­sup­p­ri­mier­te Men­schen patho­gen sein kann, wur­de er als  ein Indi­ka­tor­keim für die Was­ser­qua­li­tät in Schwimm­bä­dern mit einem Höchst­wert von 10 Kei­men pro 100 ml aus­ge­wählt [3]. 

Die bis­he­ri­ge Nach­weis­me­tho­de nach DIN EN 16266 hat den Nach­teil, dass die in Bade­ge­wäs­sern vor­han­de­ne  Begleit­flo­ra den Test mas­siv stö­ren, die Aus­wer­tung erschwe­ren und daher oft zu hohe Keim­zah­len gemes­sen wer­den [4].  Die Emp­feh­lung des Umwelt­bun­des­am­tes (UBA) von 2008, den Test bei 42°C durch­zu­füh­ren, führ­te zu bes­se­ren Ergeb­nis­sen, lös­te jedoch nicht das Pro­blem der stö­ren­den Begleit­flo­ra [5].

Eine in den letz­ten Jah­ren zuneh­mend ein­ge­setz­te Metho­de zum Nach­weis von spe­zi­el­len Mikro­or­ga­nis­men­ar­ten beruht auf dem Prin­zip der Gen­son­den­tech­nik [6]. Grund­la­ge die­ser Tech­no­lo­gie ist die in den letz­ten Jah­ren gewon­ne­ne Erkennt­nis, dass vie­le Bak­te­ri­en­ar­ten eine cha­rak­te­ris­ti­sche spe­zi­fi­sche Gen­se­quenz auf­wei­sen. Gene bestehen aus DNA, die die Infor­ma­tio­nen für die Bil­dung aller Pro­te­ine eines Lebe­we­sens ent­hält. Die­se Infor­ma­ti­on ent­steht  durch die Gen­se­quenz, die wie­der­um durch die unter­schied­lich lan­ge Abfol­ge von vier ver­schie­de­nen „Buch­sta­ben“, den Nukleo­tid­ba­sen, gebil­det wird.  Das Genom von Ps. aeru­gi­no­sa ent­hält z.B. 6,3 Mio. die­ser Nukleo­tid­ba­sen, die die Infor­ma­ti­on für 5.570 Gene tra­gen [7]. Für die art­spe­zi­fi­schen Tei­le der Gen­se­quenz kön­nen nun Poly- oder Oli­go­nu­kleo­ti­de syn­the­ti­siert wer­den (sog. kom­ple­men­tä­re Sequen­zen), die sich aus­schließ­lich an genau die­sen Stel­len des Genoms anla­gern.  Die­se Gen­son­den kön­nen dann noch mit Farb­stof­fen  gekop­pelt wer­den, damit sie sicht­bar und quan­ti­ta­tiv mess­bar wer­den.

Im Jahr 2003 wur­de ein Gen­son­den­test für Ps. aeru­gi­no­sa vor­ge­stellt, der bis­her jedoch in Bade­ge­wäs­sern nicht ein­ge­setzt wur­de [8]. Ein Ver­gleich des Ablauf­sche­ma­ta von Gen­son­den­tests und der  Metho­de nach DIN EN 16266 zeig­te, dass der Gen­son­den­test hin­sicht­lich Hand­ha­bung und Zeit­be­darf Vor­tei­le gegen­über der her­kömm­li­chen Metho­de auf­weist: So wer­den für den Gen­son­den­test sechs Ver­fah­rens­schrit­te mit einem Zeit­be­darf von nur ins­ge­samt 26 h benö­tigt, wäh­rend die her­kömm­li­che Metho­de sie­ben Schrit­te beinhal­tet, die zwi­schen 112  und 208 h dau­ern [9].

Daher wur­de ASA vom ABS damit beauf­tragt, den Gen­son­den­test im Bereich der Natur­schwimm­bä­der anzu­wen­den und mit der der­zeit ein­ge­setz­ten Nach­weis­me­tho­de auf Cetri­mid-Agar nach  DIN EN 16266 zu ver­glei­chen.

Unter­su­chun­gen im Labor­be­reich

Bereits 2013 wur­den umfang­rei­che Unter­su­chun­gen im Labor­be­reich mit stan­dar­di­sier­ten Bak­te­ri­en­sus­pen­sio­nen durch­ge­führt. Hier­zu wur­den Rein­kul­tu­ren des Stam­mes  Ps. aeru­gi­no­sa PAO 1 (DSMZ 22644)  mit  ver­schie­de­nen Keim­zah­len her­ge­stellt und die­se mit jeweils 1.000 K/ml Ps. put­ida sowie der Bak­te­ri­en­misch­kul­tur ASA T beimpft. Die so prä­pa­rier­ten Bak­te­ri­en­sus­pen­sio­nen wur­den mit der DIN EN 16266 (mit Inku­ba­ti­on bei 30° und 42°C) und dem Gen­son­den­test auf den Gehalt an Ps. aeru­gi­no­sa unter­sucht.

Zusam­men­fas­send konn­ten fol­gen­de Erkennt­nis­se gewon­nen wer­den, die auch publi­ziert wur­den [9]:

  • die mit der DIN-Metho­de ermit­tel­ten Keim­zah­len für Ps. aeru­gi­no­sa lagen in Gegen­wart ande­rer Bak­te­ri­en im Ver­gleich zur Gen­son­den­me­tho­de fast immer  höher, teil­wei­se mehr als dop­pelt so hoch.
  • Unab­hän­gig von der Nach­weis­me­tho­de zeig­te sich bei der Unter­su­chung von Gewäs­ser­pro­ben, dass die Pro­ben­vor­be­hand­lung im Labor einen erheb­li­chen Ein­fluss auf die Ergeb­nis­se hat. Grund hier­für ist wahr­schein­lich die Eigen­schaft der Ps. aeru­gi­no­sa-Zel­len zu agg­re­gie­ren oder in Bio­fil­men zu wach­sen [10]. So konn­ten die Mess­wert­schwan­kun­gen inner­halb einer Pro­be durch eine ein­fa­che Pro­ben­vor­be­hand­lung (30 min rüh­ren) deut­lich redu­ziert wer­den (bis zu < 5 %).
  • Da Ps. aeru­gi­no­sa unter gerin­gen Nähr­stoff­ge­hal­ten in Bio­fil­men wächst, schein­t­ei­ne homo­ge­ne Ver­tei­lung in Bade­tei­chen eher zwei­fel­haft. Somit sind aus Bade­ge­wäs­sern ent­nom­me­ne Pro­ben nur begrenzt bzw. sel­ten reprä­sen­ta­tiv hin­sicht­lich die­ses Kei­mes.
  • Aspek­te wie Ort und Zeit­punkt der Pro­be­nah­me, z. B. kurz nach einem zufäl­li­gen Abrei­ßen von Bio­film­tei­len, kön­nen die gemes­se­ne Keim­zahl maß­geb­lich beein­flus­sen und so die Bedeu­tung der gemes­se­nen Wer­te hin­sicht­lich der Schwimm­bad­hy­gie­ne in Fra­ge stel­len oder zumin­dest rela­ti­vie­ren.

Ver­gleich der Nach­weis­me­tho­den durch umfang­rei­che Feld­ver­su­che

Um die im Labor­be­reich gewon­ne­nen Erkennt­nis­se sowie den Test­ver­gleich auf eine brei­te­re Daten­ba­sis zu stel­len, wur­den wäh­rend der Bade­sai­son 2015 fol­gen­de acht Natur­bä­der für Feld­ver­su­che aus­ge­wählt:

OSIR Skal­ka, Swie­tocho­wice, Polen

Sig­tu­na kom­mun, Märs­ta, Schwe­den

Natur­frei­bad Her­ren­berg

Sta­di­on­bad Bre­men

AQWA Wall­dorf

Natur­bad im Sta­den, Idar-Ober­stein

Natur­bad Rie­hen, Schweiz

Frei­bad Frosch­loch, Dort­mund.

Die Pro­be­nah­me erfolg­te durch die jewei­li­gen Unter­su­chungs­äm­ter bzw. –labo­re oder Betrei­ber.

Die Pro­ben wur­den in Kühl­bo­xen mit Kühl­ele­men­ten und 24 h‑Service ver­sandt.

Die Pro­ben wur­den bis zur Ver­ar­bei­tung auf Eis gela­gert. Auf Grund even­tu­el­ler Inho­mo­ge­ni­tä­ten wur­de eine Pro­ben­vor­be­hand­lung in Form von mind. 30 min mischen (Magnet­rüh­rer) vor­ge­nom­men.

Die Bestim­mung von Ps. Aeru­gi­no­sa erfolg­te durch den Gen­son­den­test [8] sowie gemäß

DIN EN 16266 (mit UBA-Emp­feh­lung 2008).

Ergeb­nis­se

Die ursprüng­li­che Annah­me, dass die Gen­son­den­me­tho­de gerin­ge­re Keim­zah­len detek­tiert, kon­ne durch die Daten aus allen acht Bädern nicht bestä­tigt wer­den. Grund hier­für ist sicher­lich, dass das Ver­hält­nis zwi­schen Fremd­kei­men und Ps. aeru­gi­no­sa in der Labor­ver­su­chen deut­lich höher war als in den meis­ten Pro­ben aus den Feld­ver­su­chen. Bei­spiel­haft zeigt sich dies an den Wer­ten aus Natur­bad a  (Abbil­dung 1, Tabel­le 1). Somit scheint die Metho­de DIN EN 16266 bei star­ker Begleit­flo­ra stör­an­fäl­li­ger zu sein. Die Ursa­che hier­für könn­te sein, dass die Ps. aeru­gi­no­sa-Zel­len von der Begleit­flo­ra über­wach­sen und so nicht detek­tiert wer­den.

Abbil­dung 1: Mess­wer­te Ps. aeru­gi­no­sa (Gen­son­de) Natur­bad a (06–09/2015)
Tabel­le 1: Ergeb­nis­se Natur­bad a
ASA Pro­be Nr.Ps. aeru­gi­no­sa [K/100 ml]
Pro­be­nah­me­ort bzw. ‑bezeich­nungDatumDIN EN 16266Gen­son­den­test
12Strand 23/6  (Beach­pool)26.06.152717
13Hopp 23/6 (Jump­pool)26.06.154630
14Pump­hus 23/6 (After fil­tra­ti­on)26.06.157035
15Moti­on 23/6 (Ath­let pool)26.06.151911
53Beach­pool                    127.07.1500
54After Fil­tra­ti­on               227.07.1502
55Ath­let­pool                     327.07.1502
56Jump­pool                      427.07.1524
86Beach­pool                    110.08.1502
87After Fil­tra­ti­on               210.08.1502
88Ath­let­pool                     310.08.1584
89Jump­pool                      410.08.1520
116Beach Pool            124.08.15020
117After Fill­ra­ti­on        224.08.1506
118Swim­ming Pool      324.08.1544
119Jum­ping Pool         424.08.1502
172After fil­tra­ti­on        107.09.1550164
173Beach pool           207.09.151034
174Jump pool            307.09.151878
175Ath­let pool           407.09.154060

Wei­ter­hin erga­ben die Ergeb­nis­se, dass es wich­tig ist, die Pro­ben schnellst­mög­lich zu ver­mes­sen: Die Ergeb­nis­se der Pro­ben aus Natur­bad b zei­gen, dass bei einer Lage­rung über 24 Stun­den die Keim­zahl trotz Küh­lung abnimmt (Tabel­le 2).  

Tabel­le 2: Ergeb­nis­se Natur­bad b
ASA Pro­be Nr.Ps. aeru­gi­no­sa [K/100 ml]
nach Lager­zeit
Pro­be­nah­me­ortDatum2 Tage6 Tage
23Rein­was­ser 1 07.07.15423
24Rein­was­ser 207.07.15800
25Becken­was­ser 307.07.15640
26Becken­was­ser 407.07.15700

Ein gegen­läu­fi­ger Effekt der Lager­zei­ten wur­de mit Pro­ben aus Natur­bad c fest­ge­stellt: Hier nah­men die Keim­zahl­wer­te nach mehr­tä­gi­ger Lage­rung teil­wei­se um mehr als das Zehn­fa­che zu (Tabel­le 3). Grund hier­für ist wahr­schein­lich die Eigen­schaft der Ps. aeru­gi­no­sa-Zel­len zu agg­re­gie­ren oder in Bio­fil­men zu wach­sen, die sich bei der Lage­rung lösen. Dies ist wahr­schein­lich auch der Grund dafür, dass bei der ers­ten Ana­ly­se (nach Erhalt der Pro­be) Dop­pel­wer­te teil­wei­se nicht aus­ge­wer­tet wer­den konn­ten.

Unab­hän­gig von der Ergeb­nis­in­ter­pre­ta­ti­on erweist sich die Bio­film­bil­dung durch Ps. aeru­gi­no­sa auch hier wie­der als Pro­blem für die Gewin­nung von reprä­sen­ta­ti­ven und homo­ge­nen Pro­ben. Damit stellt sich erneut die Fra­ge nach der Sinn­haf­tig­keit der Aus­wahl die­ser Bak­te­ri­en­art als Leit­keim zur Beur­tei­lung der Hygie­ne von Bade­ge­wäs­sern.

Tabel­le 3:  Ergeb­nis­se Natur­frei­bad c
ASA Pro­be Nr.Ps. aeru­gi­no­sa [K/100 ml]
nach Lager­zeit
Pro­be­nah­me­ortDatum1 Tag6 Tage
124P125.08.15380
125P225.08.15101.000
129P625.08.15010
130P725.08.152620
135P1625.08.15030
136P1725.08.15301.460
137P2225.08.15     >4001.800
138P2325.08.15>4001.500
145P326.08.156100
149P726.08.15>40013.700
150P826.08.1520550
153P1126.08.1501.285
154P1626.08.1570670
155P1726.08.15>400600
156P2026.08.156100

Zusam­men­fas­sung

Der Gen­son­den-Test im Ver­gleich zur Metho­de DIN EN 16266 wird gerin­ger durch die bak­te­ri­el­le Begleit­flo­ra beein­flusst. In Gewäs­ser­pro­ben mit gerin­ger Keim­zahl lie­fern bei­de Test­me­tho­den ähn­li­che Ergeb­nis­se. Auch unter kon­trol­lier­ten küh­len Trans­port- und Lager­be­din­gun­gen ist eine schnellst­mög­li­che Ver­mes­sung der Gewäs­ser­pro­ben unbe­dingt not­wen­dig.

Die Eigen­schaft der Ps. aeru­gi­no­sa-Zel­len, zu agg­re­gie­ren oder in Bio­fil­men zu wach­sen, erschwert die Ent­nah­me von reprä­sen­ta­ti­ven und homo­ge­nen Pro­ben aus Bade­ge­wäs­sern. Die Eig­nung von Ps. aeru­gi­no­sa als Leit­keim zur Beur­tei­lung der Schwimm­bad­hy­gie­ne scheint damit frag­lich.

Lite­ra­tur

  • 1. Win­gen­der, J., Hamb­sch, B. und Schnei­der, St.: Mikro­bio­lo­gisch-hygie­ni­sche Aspek­te des Vor­kom­mens von Ps. aeru­gi­no­sa im Trink­was­ser. ener­gie-was­ser-pra­xis 60 (2009) 60–66.
  • 2. Schoe­nen, D.: Wachs­tums­be­din­gun­gen von Ps. aeru­gi­no­sa unter beson­de­rer Berück­sich­ti­gung der Ver­hält­nis­se in Trink­was­ser­ver­sor­gungs­sys­te­men. Gfw-Was­ser Abwas­ser 150 (2009) 1012–1015
  • 3. Hygie­ni­sche Anfor­de­run­gen an Klein­ba­de­tei­che (künst­li­che Schwimm- und
  • Bade­teich­an­la­gen). Bun­des­ge­sund­heits­bl — Gesund­heits­forsch — Gesund­heits­schutz 2003 · 46 (2003) 527–529
  • 4. Hei­ne­mey­er, E.-A., und Luden, K. (Nie­der­säch­si­sches Lan­des gesund­heits­amt, Außen­stel­le Aurich): Pro­ble­me bei der An wen­dung der DIN EN 12 780 zum Nach­weis
  • von Pseu­do­mo­nas aeru­gi­no­sa aus Schwimm­tei­chen und Ober­flä­chen­ge­wäs­sern. Bun­des­ge­sund­heits­bl – Gesund­heits­forsch – Gesund­heits­schutz 52 (2009)
  • 345–351
  • 5. Emp­feh­lung der Schwimm- und Bade­be­cken­was­ser­kom­mis­si­on: Hin­wei­se für die Über­wa­chung von Klein­ba­de­tei­chen zur Bestim­mung von P. aeru­gi­no­sa nach
  • der DIN EN ISO 16 266. Bun­des­ge­sund­heits­bl – Gesund­heits­forsch – Gesund­heits­schutz 52 (2009) 370 f.
  • 6. Schlei­fer, K. H., Lud­wig, W., und Amann, R.: Gen­son­den und ihre Anwen­dung in der Mikro­bio­lo­gie. Natur­wis­sen­schaf­ten 79 (1992) 213–219
  • 7. Sto­ver, C.K. et al.): Com­ple­te geno­me sequence of Pseu­do­mo­nas aeru­gi­no­sa PAO1, an oppor­tu­ni­stic patho­gen. Natu­re. 406(6799) (2000)  959–964
  • 8. Sna­i­dr, J.: Gen­son­den zum schnel­len und spe­zi­fi­schen Nach­weis von Pseu­do­mo­nas aeru­gi­no­sa. GIT Labor-Fach­zeit­schrift. 3 (2003) 2–3
  • 9. Cor­des, A. und Hofe­rich­ter, P.: Quan­ti­ta­ti­ve Bestim­mung von Pseu­do­mo­nas aeru­gi­no­sa mit­tels Gen­son­den. AB Archiv des Bade­we­sens 6 (2014) 360–366
  • 10. Hum­mel, A., Umwelt­bun­des­amt: P. aeru­gi­no­sa im Bade­was­ser – Pro­ble­me beim Nach­weis.
  • 6. Nord­baye­ri­sche Trink­was­ser­ta­ge 26. — 27.09.2012